撰文：肿瘤代谢挖掘工肿瘤代谢领域系列文献精读期期刊：NatureCellBiology标题：FBP1lossdisruptslivermetabolismandpromotestumorigenesisthroughahepaticstellatecellsenescencesecretome作者：M.CelesteSimon（宾夕法尼亚大学）、李博（中山大学）M.CelesteSimon：美国宾夕法尼亚大学医学院教授，研究方向为肿瘤代谢、肿瘤免疫学、肿瘤转移和细胞缺氧反应；李博：中山大学中山医学院教授，年至年在美国宾夕法尼亚大学医学院从事博士后研究工作，师从M.CelesteSimon教授。既往主要研究成果：揭示果糖-1,6-二磷酸酶（FBP1）对于肾癌肿瘤的双重抑制作用（Nature,）；以神经母细胞瘤为模型，揭示癌基因MYC调控谷氨酰胺代谢和细胞凋亡的分子机制（CancerCell,）。研究亮点1.本文阐明了肝脏细胞代谢与肝星状细胞（HSCs）衰老在调控肝癌进展中的作用；2.肝脏特异性敲除FBP1导致脂肪变性，并伴随着HSCs活化和衰老，表现出衰老相关的分泌表型；3.肝脏特异性敲除FBP1通过释放高迁移率族蛋白B1（HMGB1,具有促炎作用）促进HSCs活化；4.揭示了抗衰老类药物（Bcl-2抑制剂ABT-）可通过消耗衰老HSCs抑制肝癌进展，为靶向肿瘤微环境中的抗衰老治疗肝癌提供了理论依据；图1-衰老的HSCs促进肝癌的发生与发展研究背景肝癌仍然是世界范围内导致癌症相关死亡的主要原因（图2）。由基因突变导致的肝癌异质性使得其靶向治疗的有效性降低，最近对于肝癌的研究主要集中于肝癌微环境，包括纤维化和慢性炎症。80%以上的肝癌都会发生肝纤维化，研究表明肝星状细胞（HSCs）活化和转分化可导致肝纤维化。此外，非酒精性脂肪肝（NAFLD）肝脏代谢异常和脂质聚积引起的，对于肝癌来说也是一个重要的诱发因素。基于此，肝细胞与微环境中的基质细胞之间的交互作用尚待阐明。图2-年按性别分类的新生癌症病例和死亡病例排名（前十）[1]图3-肝癌致病机理总览[2]图4-免疫细胞与肝癌的关系[3]代谢重编程已被定义为肿瘤细胞的标志性特征之一。果糖-1，6-二磷酸酶（FBP1）是糖异生的限速酶，其在多数肿瘤中均下调。虽然已有研究表明，FBP1低表达与癌症低生存率和高复发率相关。但在肿瘤中FBP1的下调对肿瘤代谢重编程的影响及其对肿瘤微环境的调控仍鲜有报道。本文作者通过构建肝脏条件性敲除FBP1的小鼠来研究FBP1下调对肝脏代谢及其肝癌微环境的影响。研究结果解析1.肝癌进展过程中FBP1表达下调肿瘤细胞在有氧状态下增强葡萄糖的摄取量，并且伴随乳糖的生成增多，这一现象称为Warburg效应或有氧糖酵解。于糖酵解对应的反过程为糖异生。本文作者通过TCGA数据库分析了糖异生限速酶（G6PC,FBP1和PCK1）在肝癌中的表达情况，发现在肝癌中这三个限速酶的表达量均下调，且FBP1的表达水平随着肝癌的进展表达量依次降低（图5a,b）。同样的，病理切片的结果显示，与正常组织相比，肝癌中FBP1的蛋白丰度明显下调（图5c）。此外，FBP1的表达水平在两个肝癌小鼠模型中（抑癌基因p53缺失和DEN处理）也呈下降趋势（图5d,e）。以上数据显示在肝脏肿瘤发展过程中FBP1的表达量显著下调。图5-肝癌进展过程中FBP1表达下调2.肝脏特异性敲除FBP1导致肝脏代谢紊乱为了探究FBP1在肝脏中的功能，研究人员构建了在肝脏中条件性敲除FBP1的小鼠。分别通过丙酮酸耐受检测和葡萄糖耐受检测发现，肝脏中特异性敲除FBP1（AAV8–TBG–Cre）后小鼠的糖异生作用被阻断，然而其对葡萄糖的敏感性仍保持不变（图6a,b）。接着，研究人员发现，肝脏中特异性敲除FBP周后，小鼠表现为轻度肝脂肪变性，甘油三酯升高，中性脂质积聚（图6c）。投射电镜结果显示，敲除FBP1后肝细胞内质网形态异常扩张，与线粒体外膜相连，呈现出内质网应激特征（图6d,e）。RNA-Seq及基因富集（GSEA）分析均显示，肝脏特异性敲除FBP1后，内质网应激、糖酵解、氧化磷酸化、炎症相关和脂质代谢相关基因表达均上调（图6f,g）。以上结果表明，肝脏中特异性敲除FBP1后导致脂质代谢紊乱与内质网应激。图6-肝脏特异性敲除FBP1导致肝脏代谢紊乱3.敲除FBP1促进小鼠肝癌的发展用DEN诱导肝脏特异性敲除FBP1的小鼠24周后，发现敲除FBP1表现出较明显的肿瘤负荷（图7a,b），肝/体重比升高（图7d,e），并伴有较多的脂肪病变和较高的血清谷丙转氨酶（ALT）活性（图7f）。此外，在这一阶段敲除FBP1的小鼠的肝脏细胞增殖能力显著增加（图7g,h），并且肝癌特异基因表达上调（图7i）。值得注意的是，敲除FBP1小鼠门静脉周围出现纤维化，如胶原沉积（图7j,k）。正如预期的那样，在DEN诱导36周后，敲除FBP1明显促进了肝癌的发生（图7l）。此外本文作者运用DEN诱导p53/Fbp1双敲的小鼠肝癌模型和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）诱导的肝癌模型均证实了以上表型。上述三种小鼠肝癌模型均表明，肝脏特异性敲除FBP1促进原发性肝癌的进展。图7-敲除FBP1促进小鼠肝癌的发展4.敲除FBP1诱导肝星状细胞（HSCs）衰老及衰老相关分泌表型(senes-cence-associatedsecretoryphenotype,SASP)越来越多的研究表明肝癌的发生发展与其所处的肝癌微环境有着紧密联系。肝星状细胞（HSCs）是间质细胞的一种，广泛存在于人体肝脏组织中，其在肝脏受到病理因素侵袭时会发生活化，参与各种病理过程，同时也参与组成肝癌的微环境，影响细胞外基质的代谢，与原发性肝癌的发生和进展密切相关。用DEN诱导肝脏特异性敲除FBP1的小鼠显著表现出肝纤维化，这意味着HSCs在这一过程中可能能够促进肝癌的发生与发展。在肝纤维化过程中，活化的HSCs发生衰老，纤维化能力减弱，并促进炎症反应。研究人员通过衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色发现在肝癌周边区域，用DEN诱导肝脏特异性敲除FBP1的小鼠肝脏中检测到了大量的SA-β-Gal+细胞以及HSCs的特异标记CDB（图8a）。另外，研究人员还观察到两个衰老标志物p21和FOXO4在肿瘤周围的表达（图8b）。重要的是，SA-β-Gal+细胞与α-SMA（HSCs活化的标志）和IL6（SASP成分）阳性细胞存在定位，并且α-SMA+HSCs中的相当一部分也表达DNA损伤标记物γ-H2AX（图8c,d），共同为HSCs衰老的存在提供理论依据。以上数据表明，敲除FBP1可诱导HSCs衰老及衰老相关分泌表型。图8-敲除FBP1诱导HSCs衰老及SASP5.衰老的肝星状细胞促进肝癌发生为了确定FBP1缺失导致的HSCs衰老是否能够促进肝癌发生，研究人员使用DNA损伤剂etoposide来诱导人HSCs的衰老。与对照细胞相比，经etoposide处理的人HSCs呈现出SA-β-Gal阳性（图9a,b）、细胞生长停滞（图9c）和SASP基因的表达（图9d）。同样的，经etoposide处理的小鼠原代HSCs显著分泌多种SASP蛋白，包括促肿瘤因子IL6和CXCL1（图9e）。此外，利用含有衰老的HSCs（SEN-HSCs）分泌蛋白的条件培养基处理人肝癌细胞（PLC/PRF/5），明显促进了肝癌细胞的增殖与克隆性生长（图9f-h）。更重要的是，在小鼠中，联合注射SEN-HSCs可显著增加肝癌细胞异种移植瘤的生长（图9i）。综上所述，肝星状细胞衰老分泌物可促进小鼠和人肝癌的进展。图9-衰老的HSCs促进肝癌发生6.抗衰老类药物治疗可减缓FBP1缺失导致的肝癌进展已有研究报道衰老细胞可被抗衰老类药物选择性靶向，包括dasatinib+quercetin(D+Q),和ABT-(Navitoclax)。那么，抵抗HSCs衰老是否能够抑制FBP1缺失导致的肝癌进展呢？与对照组相比，间断性D+Q治疗可减少DEN诱导肝脏特异性敲除FBP1小鼠的肿瘤数量，进而抑制肝癌的进展（图10a,b），并且小鼠肝脏显微创伤明显减少（图10c）及表达SASP的HSCs的数量明显减少（图10d,e）。此外，经D+Q治疗后并没有改善肝纤维化（图10f）。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（TUNEL）染色显示，经D+Q治疗后，仅仅肿瘤周围区域的细胞凋亡增加，总体上排除了对肝细胞、活化的HSCs和肿瘤细胞的影响。然而DEN诱导肝癌36周后，D+Q治疗组病变明显减少（图10h,i）及SA-β-Gal+细胞数量减少（图10j），但BrdU+增殖性HSC比例未见明显变化，表明D+Q治疗仅针对衰老的HSCs。与D+Q治疗一致，ABT-给药后，肿瘤数量和大小明显下调（图10k,l），SA-β-Gal+细胞数减少，并降低了IL6的表达（图10o,p）。因此，靶向清除衰老的HSCs可延缓FBP1缺失导致的肝癌进展。图10-抗衰老治疗抑制了由FBP1缺失导致的HSCs的SASP和肝癌进展7.高迁移率族蛋白B1（HMGB1）促进HSCs的激活和衰老相关分泌表型为了确定调节缺失FBP1的肝细胞与HSCs之间交互作用的调控因子，研究人员分别收集了DEN诱导24周后的对照组和肝脏特异性敲除FBP1的原代肝细胞的培养基，通过无标记定量法进行蛋白质组学分析。通过对差异蛋白的分析发现，缺失FBP1能够促进高迁移率组蛋白（HMGB1,一种已知的调节慢性肝损伤和HSCs活化的损伤相关因子）的分泌（图11a）及其核质易位（图11b）。通过阻断HMGB1的分泌（ICM处理）可显著减少由FBP1缺失引起的肿瘤大小和数量（图11c）及其显微损伤（图11d）。此外，ICM处理显著减少了表达SASP成分（图11e,f）及SA-β-Gal+的HSCs的数量（图11g）。此外，ICM治疗确实也显著减轻了肝脏特异缺失FBP1小鼠的肝纤维化，以及纤维化基因表达显著下调和胶原沉积（图11h）。综上所述，HMGB1作为调节缺失FBP1的肝细胞与HSCs之间交互作用的关键调控因子促进肝癌进展。图11-HMGB1介导的FBP1缺失肝细胞与HSCs间的交互作用文章总结本文揭示了糖异生酶FBP1作为抑癌基因通过调控肝脏脂代谢和内质网应激调控肝细胞与HSCs之间的交互作用，进而抑制肝癌发生的功能与机制。缺失FBP1导致肝细胞脂代谢紊乱和内质网应激，通过促进HMGB1的分泌，激活HSCs及其衰老，并最终通过衰老HSCs分泌的SASP促进肝癌的进展。为肝癌发生过程中肝脏代谢变化，免疫细胞组成及基质细胞HSCs之间的交互作用提供了一个新的研究方向。抗衰老类药物可能是治疗癌症的一种适用性策略。本文阐述了间歇性抗衰老药物的治疗可通过消除衰老的HSCs，延缓肝癌的进展。基于此，本文作者提出合理地靶向肿瘤细胞或基质细胞的衰老是潜在的治疗肝癌的策略，抗衰老类药物的联用在肝癌的临床治疗中具有巨大的潜力。
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