·论著·
高浓度血红素降解产物对肝功能和血流动力学的影响
罗磊译；段钟平审校
(SeidelRA,etal；Impactofhigher-orderhemedegradationproductsonhepaticfunctionandhemodynamics.JHepatol.;67(2):-81)
背景和目的：先前认为，胆绿素和胆红素是血红素分解的最终产物。然而,现有证据表明，胆绿素和胆红素可以进一步的降解为有生物活性的物质（Z-BOX-A和Z-BOX-B）。Z-BOX-A和Z-BOX-B是在氧化过程中产生并对肝细胞功能和完整性有未知影响的物质。我们研究了Z-BOX-A和-B对肝脏功能的影响并探讨了他们在健康状况和胆汁性疾病时方面的变化。方法：在本研究中，分别在大鼠体内、HepG2与HepaRG肝癌系、人永生化肝细胞与离体肝脏组织中研究了Z-BOX-A与-B的功能性影响及其机制。利用液相色谱-串联质谱（LCMS/MS）法测定Z-BOXA和-B在急性和慢加急性肝衰竭和遗传性高胆红素血症的含量。结果：Z-BOX-A和B在人类中与在生理条件下的啮齿动物有相似的数量。胆汁淤积性型肝衰竭的患者(P＜0.)和遗传性缺乏胆红素葡萄糖醛酸症的大鼠(P＜0.)中Z-BOX-A和B的含量增加20倍。药代动力学研究结果显示，Z-BOXA的血清半衰期较其同分异构体B短(P=0.)。两种物质均由肝细胞摄取，但Z-BOXA的摄取量是-倍，并随胆汁排泄。尽管他们报告了在大脑血管系统中的血管收缩特性，但BOXes不影响门静脉血流动力学。Z-BOX-A和B都显示了细胞毒性方面的剂量依赖性，影响谷胱甘肽的氧化还原状态，并差异的调整Rev-erbα和Rev-erbβ的活性。此外,BOXes可触发肝细胞的骨架重构。结论：我们的数据提供了高浓度血红素降解产物的证据，即Z-BOX-A和-B，能损害肝细胞的完整性，且有调解肝内和肝外细胞毒性作用，在以前被认为是高胆血素血症所致。总结：血色素的降解产生了胆色素胆红素和氧化产物Z-BOX-A和-B。这些生物活性分子的血清浓度增加可增加黄疸的发生，可损害肝功能和肝细胞的完整性。当添加到培养的肝细胞或注入到健康的老鼠体内时，在肝衰竭患者中观察到的Z-BOX-A和B的数量对肝脏功能有深远的影响。
简介
血红素(铁原卟啉IX)作为一个参与各种有关氧运输、氧化还原反应和信号传导蛋白质的载体。当被释放的时候，不稳定的血红素就像一种被清道夫系统激活的预警素和细胞毒性物质。细胞内血红素浓度由被血红素加氧酶（HO）降解的产物严格控制，产生的一阶降解产物是胆绿素、铁和一氧化碳（CO）。HO-1的诱导反映了细胞对氧化应激的反应，并在感染和炎症过程中给予组织保护。通过胆绿素还原酶由胆绿素生成的胆红素，通过其抗氧化性能有助于组织的完整性。然而，在一定的阈值以上，胆红素可引起肝内外功能异常，包括神经毒性和胆血症肾病。在氧化应激条件下，未结合胆红素氧化为高阶降解产物，如主要胆红素氧化终产物（BOXes），包括在特定的区域异构体的Z-2-(4-methyl-5-oxo-3-vinyl-1,5-dihydro-2h-pyrrol-2-ylidene)乙酰胺（Z-BOX-A）和Z-2-(3-methyl-5-oxo-4-vinyl-1,5-dihydro-2h-pyrrol-2-ylidene)乙酰胺（Z-BOX-B）。
蛛网膜下腔出血情况下，Z-BOX-A和-B介导的血管收缩作用，可能是通过抑制钙离子通道和电压依赖性钾通道Slo1产生的。然而，对这些高阶降解产物的系统评价受限是由于至今仍缺乏分析工具和相应的纯度盒。为了系统地评估这些物质的代谢和功能，我们最近建立合成、纯化和敏感性分析的Z-BOX-A和-B。鉴于肝脏在血红素降解方面的核心作用，我们研究了Z-BOX-A和-B的药代动力学，并探索了其对肝功能的影响。
材料和方法
试剂盒的准备
Z-BOXA和Z-BOXB的制备通过体外胆红素氧化和化学合成的方法。异构体纯度通过液相色谱结合串联质谱（LCMS/MS）和核磁共振谱证实。水溶性和分区常数（正辛醇/水）应用分光光度法测定。
试剂盒的量化
对Z-BOX-A和-B同时测定是通过LC-MS/MS实现的。为了评估Z-BOX-A和-B在血清和血浆中的浓度差别，将制备的人血清和血浆标本均添加至80或nmol.L-1，进行相应的分析。
人体标本的采集
所有的材料收集均得到耶拿大学伦理委员会批准，并取得所有受试者或其法定代理人的知情同意（-08/12；-12/08；-11/12；-12/09；-11/07；-04/15）。在完成了肝衰竭诊断标准的患者28例血浆标本（急性肝衰竭ALF，n=9；慢加急性，ACLF，n=15；移植失败，n=4）。10名健康志愿者作为对照组。
啮齿动物
雄性Wistar大鼠（–g，哈伦实验室）、纯合子耿氏鼠（-g内部繁殖）和C57BL/6J小鼠（25–30g;内部繁殖）的使用经过实验动物福利委员会的批准（图林根州办公室的消费者保护和食品安全，巴特朗根萨尔察，德国，02-/11/14，02-；动物伦理委员会的格罗宁根大学，格罗宁根，荷兰，deca）的异氟醚吸入麻醉。
PK/PD研究
老鼠通过右颈静脉导管注入Z-BOX-A和Z-BOX-B（26.7ug/kg）含0.25%的DMSO），从左颈动脉进行血液取样，胆管为胆汁收集。注入之前和之后的60分钟留取尿液。
门脉血流动力学
老鼠肝脏通过门静脉灌注进行高饱和三羧酸循环。Henseleit(德国柏林;德国)含有2g/L的葡萄糖，应用适用于体重的持续流速（ml/kg/min）下进行缓冲。Z-BOXA、Z-BOX-B或媒介物被主流速单独影响。在进行胆汁取样时，测定门静脉压力（tsda，10或20Hz，BIOPACSystems，Goleta，CA，USA）和0.01Hz的低通滤波（OriginLab，北安普敦，美国）。
细胞培养
除非另有说明，所有的试剂都是从生命技术公司(德国达姆施塔特)获得的。HepG2细胞（DSMZ，布伦瑞克，德国；短串联重复序列（STR）分析认证）是在黑暗中37℃条件下使用DMEM培养基（DMEM）/营养混合物F-12（1:1），进行培养的，补充10%的胎牛血清(FBS)和1ug/ml的链霉素及1u/ml的青霉素。代谢率(MTT分析)和乳酸脱氢酶(LDH)的释放(罗氏诊断，曼海姆，德国)根据制造商的指示分析，含有1%的FBS在Z-BOX-A、Z-BOX-B和赋形剂处理后96h。EC50应用f=min+(max-min)/(1+10logEC50-x)公式计算。使用基因编码的荧光传感器来测量细胞内谷胱甘肽氧化还原电位的变化，这种传感器由对氧化还原电位敏感的绿色荧光蛋白(roGFP2)和谷氧还蛋白1(Grx1)融合组成。应用比率荧光法测量(/nm;光电二极管和多铬V单色仪，光子学，德国慕尼黑，德国)单个在BOXes培养液培养基培养1小时后的HepG2细胞。HepaRG(INSERM，法国巴黎，法国)细胞是用威廉姆斯的培养基培养的，补充10%的FBS，2mmol.L-1的谷氨酰胺，2.5ng/ml的胰岛素，24.7ug/ml的氢化可的松琥珀酸，1ug/ml的链霉素和1U/ml的青霉素。末端分化是通过补充应用2%的DMSO两周诱导获得的。HepG2和HepaRG细胞的形态学研究是在Z-BOXes培养基超浓度培养24小时及48小时后进行的。包含Z-BOXA、Z-BOXB和赋形剂的培养基制备0.25%(HepG2)或1%(HepaRG)的DMSO。人类的永久肝细胞(HIH)已经被描述为一个经过在含10%小牛血清和0.5%青霉素/链霉素，含或不含Z-BOXA和Z-BOX-B的培养基中，培养48小时的传代生长的亚克隆细胞。
实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）
在RNA提取（trireagent），并逆转录后（MMLV，西格玛，奥地利），采用荧光定量法进行定量PCR（SYBR；ABIPRISM，ThermoFisher，奥地利）。在表S1中提供了引物序列。
凝胶阻滞实验
双链寡核苷酸用使用T4-多核苷酸激酶[γ32P]-ATP末端标记。在放射性标记的探针（0.5ng）添加之前，核或胞质蛋白提取物（2ug;补充材料）在室温下20μl混合缓冲液（30mmol.L-1/LHEPES，PH7.5;60mmol.L-1KCl;0.5%甘油;0.1%TritonX;1mmol.L-1DTT）中温育15分钟。结合反应在Rev-erbα(sc-)或Rev-erbβ抗体作用下进一步孵育15分钟，并通过6%或4%聚丙烯酰胺凝胶电泳在0.25XTris-硼酸盐-EDTA缓冲液中解析。
荧光镜检法
细胞在4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色前固定在4%的甲醛中，AlexaFluor标记的毒环肽，应用LSM-激光扫描显微镜研究（蔡司，耶拿，德国）。
电子显微镜检查
在LEO-和LEO-VP仪器（Zeiss，Oberkochen，Germany）上进行电子显微镜扫描。细胞在玻璃盖玻片上生长，用2.5%戊二醛在0.1M二甲胂酸盐缓冲液中固定。样品是在升高的乙醇浓度脱水，临界点干燥和溅射镀金。统计图像评估在Xum显示窗口（n=5-13）。
统计分析
使用软件进行统计分析（SYSTAT，埃克拉特，德国）。数据（平均±SEM）进行t检验、采用Holm-Sidakposthoc分析法进行单因素方差分析，或如果方差不齐，使用相应的非参数检验。相关分析采用皮尔森积矩估计。P值小于0.05被认为是有统计学差异。对于使用的材料和方法的进一步详情，请参阅补充材料和CTAT表。
结果
BOXes在生理条件下出现并在胆汁淤积时出现明显增加
截止目前为止，还未见在全身循环情况下的Z-BOX-A和-B浓度相关研究。因此，我们首先确定在健康人、肝衰竭和遗传性高间接胆红素血症情况下Z-BOX-A和-B的血清/血浆浓度值。健康人群中，Z-BOX-A和-B总血清浓度为25.4±3.4nmol.L-1（n=10）。我们观察到Z-BOX-A和-B的浓度（.3±30.3nmol.L-1，P＜0.;n=28）在因胆汁排泄受损而致肝衰竭的患者中显著增高（图1A，B）。女性患者均值总Z-BOX-A和-B浓度（.8±54.7nmol.L-1;n=11）与男性患者相似（.8±34.9nmol.L-1，P＜0.26，n=17）。酒精性肝病亚组（.5±44.8nmol.L-1，n=9）与其他病因相比，值较低（.9±36.3nmol.L-1，P=0.;n=19）。Z-BOX-A和-B在健康Wistar大鼠（19.1±4.6nmol.L-1;n=12）和C57BL/6J小鼠（14.4±0.8nmol.L-1;n=5）的血清总浓度与健康人群相比没有差异（P＞0.85）。但是，先天性高胆红素血症的Gunn大鼠的血清BOXes浓度（.9±15.1nmol.L-1，P＜0.;n=14）与非高胆红素血症Wistar大鼠相比显著偏高（Fig.1C，D）。在所有样品中，Z-BOX-A和-B的浓度呈现强相关（r＞0.99;P=1.10-55;图1F），且与未结合胆红素及总胆红素浓度有关（r＞0.86；P=4.10-19;图1B，D;图S2）。添加相应的血清和血浆样品所得的BOXes值之间无统计学差异（血清中浓度与血浆中浓度相比：Z-BOX-A，.0±3.1%，P=0.18;Z-BOX-B，.6±2.3%，P=0.10;n=14对;配对t检验）。
体外培养的区域异构体产量
为了更好地解释两种区域异构体鉴于PK/PD数据的血液浓度，我们用过氧化氢体外降解胆红素，评估了他们的相对产量，导致分别形成1.5%Z-BOX-A和0.8%Z-BOXB。
区域异构体Z-BOXA和B具有不同的药代动力学
然后,我们研究了两个区域异构体Z-BOX-A和-B是否具有明显不同的药代动力学。将等量的Z-BOX-A和-B静脉推注入大鼠后，这两种化合物的血药峰浓度在3.5分钟达到（图2A，B）。血清内消除表现出清晰可辨的分布阶段（α）和消除阶段（β）（图2A，B插入；表。S2）。应用两室模型，两种化合物分散在相似的相对分布量在α相（≤15分钟）内为1.0L。kg-1，相当于均匀蔓延到全身体积。消除参数一级动力学显示，Z-BOX-A的血清半衰期（31.0±5.5分钟）显著低于Z-BOXB（55.4±7.9分钟，P=0.;n=5;图2C）。为了进一步阐明PK/PD，我们测定了Z-BOX-A和B的水溶性（.6mg.L-1和76.4mg.L-1）和分配常数（logPOW=0.92和1.11）。
BOXes积极进入胆汁排泄
由于Z-BOX-A和-B在静脉注射后从循环中清除，我们考虑是否通过胆道和尿液清除。我们检测到大鼠的胆汁中在静脉推注前和推注后均含有两种化合物。值得注意的是，我们发现这些BOXes在同样的大鼠相应尿样中的量很少，静脉推注前的量（Z-BOX-A+B，8.4±8.4nmol.L-1，n=8）和推注后60分钟（Z-BOXA+B，14.7±9.5nmol.L-1，P＞0.64;n=8）。然而，通过胆汁排泄的Z-BOX-A和-B，在区域异构体之间有明显的不同（图2D-F）：Z-BOX-A和B在i.v.之前的胆汁浓度（72.1±8.4nmol.L-1;.2±66.0nmol.L-1;n=8）显著高于相应的血清浓度（4.8±2.8nmol.L-1，P＜0.;12.0±5.6nmol.L-1，P＜0.;n=8）。Z-BOX-A在胆汁中富集了大于30倍的量，在胆汁中消除的平均峰浓度为7.63±1.64umol.L-1（n=5），在血清浓度达峰值后8.5分钟测量（图2A，D）。相反，Z-BOXB显示出不同的排泄特征，在胆汁中出现明显较低的峰浓度（.7±89.5nmol.L-1，物质应用后1分钟测定;P=0.，与胆汁中的Z-BOX-A相比;n=5;图2D，E）。为了检测Z-BOX-A和B不同的排泄动力学是否是由于区域异构体之间的竞争，我们单独注射Z-BOXB到大鼠进行实验（n=3）。在这种实验中，胆汁Z-BOXB的浓度显著增加（曲线下面积：44.9±18.9umol.L-1.minVS8.72±3.39umol.L-1/min，P=0.;n=3和5），尽管排泄曲线与在等摩尔应用两种区域异构体之后获得的那些不同（图2E，插图）。一旦Z-BOX-A的峰值浓度为在弹丸式静脉推注之后达到，胆汁中的Z-BOX-A浓度始终是血清的30倍以上。两个区域异构体注射后50分钟内，非代谢物质排泄到胆汁总量（图2F）分别为整个血液中总量的42.9%（Z-BOX-A）和2.4%（Z-BOXB），同等给药摩尔量，分别反映了3.88%Z-BOX-A和0.18%Z-BOX-B。除了单独i.v.推注后的PK研究，我们确定了离体灌注大鼠肝脏，应用Z-BOX-A和-B在10分钟范围内的胆汁排泄情况（图2G-1）。灌注10μmol.L-1的boxes，排出大于倍富集的Z-BOX-A（1.04±0.17mmol.L-1，n=3），而Z-BOXB（11.4±2.3umol.L-1，P=0.58;n=3）未被积极排泄进入胆汁。
Z-BOX-A和B在人胆汁和胆囊结石
为了确认Z-BOX-A和-B是否从健康人的胆汁中排泄，我们测定了经胆囊切除术后的Z-BOX-A和-B胆汁样本。发现Z-BOX-A(68.9-nmol.L-1)和Z-BOX-B(48.8–nmol.L-1)存在于在胆汁中及相应的胆结石中。
Z-BOX-A和-B不改变门静脉血流动力学
正如Z-BOX-A和B诱发脑血管收缩和血红素增加门静脉阻力，我们假设Z-BOX-A和B可能改变血流动力学。离体大鼠肝脏经过Z-BOX-A或B灌注（图3A，B）。值得注意的是，门静脉压力没有在施行或在清除周期内变化（Z-BOXA，P=0.38；Z-BOXB，P＞0.12；参考基线；n=3）。
Z-BOX-A和B对肝细胞代谢的影响
然后我们问Z-BOX-A和B是否可能影响肝细胞的完整性和代谢；HepG2细胞对Z-BOX-A和B的反应呈剂量依赖性增加，区域异构体（Z-BOX-AEC50=±umol.L-1;Z-BOX-B,±94umol.L-1;n=5)）对LDH的释放影响无显著差异。值得注意的是，绝对的毒性是边缘的（图4A–C）。MTT法显示剂量依赖性损伤代谢率分别为IC50=±umol.L-1(Z-BOX-A;n=3)；±umol.L-1(Z-BOXB;n=3)（图4D–F）。
Z-BOX选择性影响肝细胞细胞骨架组织
由于BOXes显著富集在胆汁中，肝细胞小管膜受到比血液中更高浓度的Z-BOX-A和B的影响。HepG2细胞对区域异构体Z-BOX-A和B的反应不同。虽然给予治疗量≥umol.L-1的Z-BOXA处理细胞几小时内即可诱导细胞形态学从砖样变换到球形细胞形态(图5)，Z-BOXB处理后的细胞形态与对照组细胞没有区别(图5A，B)。细胞经Z-BOX-A处理24h后被分成了三个不同的群体:(I)一种细胞膜强烈的交错折叠的球形细胞，表面扩展分布在整个细胞体，减少细胞间和细胞表面的接触。（II）细胞中间形态与功能介于第一和第三的细胞。（III）砖样形态的平贴壁细胞（作为赋形剂对照），刷状缘绒毛在顶端，且和众多细胞接触。相比之下，经Z-BOXB处理的细胞与对照组相比没有什么不同(P＞0.16;n=和个单个细胞/处理后;图5C)。值得注意的是，经Z-BOX-A处理后48h,球形细胞所占的比率与Z-BOX-A处理诱导后24h相比没有改变(P＞0.14;n=和个单个细胞/处理后）。然而，48小时后，三个引人注目的I型细胞形态是可区分的（图。S4):(a)有完整绒毛的细胞，(b)细胞膜广泛起泡的细胞，(c)没有任何可见的细胞表面扩展的细胞。
针对肝细胞的形态学改变
为了确认Z-BOX-A在体外模型的特异性效应，我们研究了HepaRG分化前双能祖细胞和终末分化为肝细胞和胆管样表型后的细胞。而未分化HepaRG细胞对Z-BOX-A的反应性像HepG2反应一样，终末分化HepaRG细胞的反应性，取决于特定的表型。有内源性调控作用的胆管样表型的细胞，持续不受影响。肝细胞样表型细胞表现出形态的改变，表现为细胞-细胞间的接触和膜泡减少（图5d）。
BOXes干扰细胞质谷胱甘肽氧化还原电位
因为Z-BOX-A和-B的结构对巯基建有反应，我们探讨这些BOXes是否影响肝细胞谷胱甘肽氧化还原状态。使用基因编码的荧光传感器Grx1-rogfp2，证明Z-BOX-A和B明显将谷胱甘肽氧化还原电位转换为更氧化的状态（通过荧光传感器的二硫键的形成测量）（图6a，图S5）。应用高分辨率的LC和MS，我们进一步证明谷胱甘肽单加合物的Z-BOX-A和-B在体外形成（图6b，图六）。分析结果显示了几个连续洗脱的化合物具有相同的高分辨率质量。初步的化学结构和这些加合物的紫外吸收光谱，与未转换的Z-BOX-A和-B相似，描绘在图S6和S7。值得注意的是，Z-BOXA显示出的对谷胱甘肽的活性是Z-BOX-B的10倍（图6B）。我们还研究了是否Z-BOX-A和-B是否可以增加HepG2细胞的脂质过氧化（实验细节见补充材料）。用这些BOXes直接孵育2小时没有导致脂质过氧化显著的变化。在Z-BOX-A启动24小时后，细胞（以及它们的变化形态）不易受氧化应激影响，通过叔丁基过氧化氢诱导（图8）。
Z-BOX-A和B修改基因表达,通过调节核受体Rev-erbα和Rev-erbβ
我们假设，如血红素那样，区域异构体Z-BOX-A和-B也可以影响核受体家族中的-BOX。暴露于Z-BOX-A或-B后，HIH显示Rev-erbα和Rev-erbβ靶基因PEPCK受抑制(P＜0.；n=3；图6C)。出人意料的是，Z-BOX-A和-B差异调节Rev-erbs自身mRNA的表达：Z-BOX-A抑制Rev-erbα(P＜0.；n=3)而不会影响Rev-erbβ的表达，而Z-BOX-B对Rev-erbα和Rev-erbβ的基因表达均无影响。此外，Rev-erbs其他靶基因的表达（脂质代谢相关基因脂肪酸去饱和酶2[FADS2]；3-羟基-3-戊二辅酶-还原酶A[HMGCR]；胆汁酸合成细胞色素的限速步骤P同工酶7A1[CYP7A1])都进行了研究(图6C)。Z-BOXB可增加FADS2和HMGCRRNA的表达(P＜0.;n=3)，而Z-BOX-A并没有影响他们的表达；然而，两种BOXes均抑制基因CYP7A1(P＜0.;n=3)。我们还使用revdr2及其废除Rev-erbs结合的突变体和HIH的胞浆或核提取物进行电泳迁移率变动分析(图6)。对照组细胞的核提取物轻微的结合到revDR2，而Z-BOX-A核提取物，丢失了以revDR2突变体表现出很强的结合。Z-BOX-B核提取物具有潜在的高和低的尺寸配合物。与revdr2突变体鉴定下尺寸复杂具体的培养。此外，通过超迁移实验，与Rev-erbα调制器sr相比，抗体对Rev-erbα和Rev-erbβ的结合专一性更强（图6c）。应用SR细胞培养，核提取物表现出与结合revdr2的复合物，与Z-BOX-A复合物的分子大小相同。Z-BOX-A核提取物结合revDR2，而Rev-erbα抗体预孵育核提取物结合度降低，表明Rev-erbα是复合物的一部分，其经Z-BOXA处理好，结合度增加。同样，Z-BOX-B核提取物结合revdr2寡核苷酸，但是Z-BOX-B的核提取物预孵育与Rev-erbβ抗体没有结合。总之，我们的研究结果表明，Z-BOX-A作为增加其结合到特定的DNA反应元件和抑制自己的表达调节的一种Rev-erbα反应活性调节器，而Z-BOX-B增加Rev-erbβ结合和调节FADS2和HMGCR的基因表达。
讨论
肝脏在血红素分解代谢中有重要作用，代谢的等摩尔量胆绿素、铁和一氧化碳，我们已知这些会影响肝脏功能或完整性。然而，缺乏关于高阶胆红素降解产物形成、代谢和功能作用的数据，特别是，区域异构体Z-BOX-A和-B。在这里，我们描述了Z-BOX-A和-B的形成，动力学以及对肝脏功能和完整性的影响。我们论证了Z-BOX-A和-B在健康人、大鼠和小鼠中有相似的基底浓度。我们也发现了在肝功能衰竭患者和先天性高胆红素血症的Gunn大鼠模型中，Z-BOX-A和-B的浓度较高。区域异构体Z-BOX-A和-B与肝细胞有不同的相互作用，导致了显著不同的血清半衰期和胆汁排泄概况。但两者均作为Rev-erbs的部分激动剂，具有相似的毒性，只有Z-BOX-A，强烈富集于胆汁，引发肝细胞骨架特征重构。改变细胞骨架的形态和在中央的转录调节对Rev-erbα和Rev-erbβ的影响同时存在，表明了排泄功能的持续损害，体内观察到胆汁产生受到严重影响（数据未显示），但不是在离体肝脏中（图2G，H），其中BOXes和胆盐浓度保持不变。与单次注射，在患者中持续存在的内源性Z-BOX-A和-B相比，大量富集的Z-BOX-A可能参与更强的BOXes对肝细胞内和肝外胆汁淤积性触发条件的影响。因此，Rev-erbα和Rev-erbβ的分子鉴定作为Z-BOX-A和-B的目标对象与他们不同的药代动力学表现一致。Rev-erbes是协调血脂、血糖和胆汁酸的合成的核受体，以及I、II相解毒酶。此外，根据Rev-erba/b双基因敲除的小鼠可知，Rev-erbes是生物钟系统的一部分，需要协调内源性和外源性代谢。有趣的是，Rev-erbes受Z-BOX-A和B的激活没有显示经典的基因表达特点，导致的假设，Z-BOX-A和-B差异性影响Rev-erbes。这可能是由于内源性配体的存在（血红素和CO），由于配体结合域通道竞争，或氧化应激导致在配体结合结构域的关键的半胱氨酸残基的改变，Z-BOX-A和-B无法充分激活Rev-erbes。被BOXes抑制的胆汁酸合成限速酶CYP7A1，可以被视为胆汁酸中毒相关胆汁淤积的一个潜在的保护机制。此外，Z-BOX-A和-B对巯基的分子反应显示出对谷胱甘肽的影响，谷胱甘肽构成肝细胞氧化还原系统的主要部分。因为Z-BOX-A和-B改变谷胱甘肽氧化还原状态不同于直接的氧化剂，如同浓度的过氧化氢浓度，我们假设Z-BOX-A和-B差异性的影响谷胱甘肽系统。Z-BOX-A和-B不增加脂质过氧化后直接应用，也不导致体外情况下对氧化应激的致敏。因此，我们得出结论，高浓度血红素降解产物的形成有助于活性氧（ROS）的解毒作用，尽管它们与谷胱甘肽相互作用。
基于BOXes对脑血管的影响，我们假设他们也可能导致门静脉血管收缩，但是实际并不是这样。虽然对两种血管床的影响不同，这一深入解读是本研究的范围之外，我们假设的效应细胞的性质，即血管平滑肌细胞对脑血管的影响及可能的肝星状细胞对门脉血流动力学的影响，可以解释这种差异。虽然BOXes可能影响终端门静脉，现有的证据都指向血红素和第一阶降解产物起主要作用，特别是CO，对肝星状细胞与平滑肌收缩作用有明显不同。
肝细胞对区域异构体Z-BOX-A和-B的反应不同。这种区域异构体的特异性，通过分别与Rev-erbα和Rev-erbβ不同的结合性表现出来。此外，Z-BOX-A和-B的药代动力学特征显示，血清和胆汁排泄的清除率差异显著。
通过ROS调节转换的胆红素降解机理尚未阐明。基于胆红素降解后区域异构体的不同化学产率，我们假设Z-BOX-A也在体内形成一个双重过剩。与Z-BOX-B相比，约两倍短的血清半衰期有望弥补这些不平等的生产速率，导致我们观察到区域异构体在血液研究中相似的平衡浓度（图1）。我们证明通过大鼠胆汁的排泄有助于血清清除，特别是Z-BOX-A。虽然胆汁中Z-BOX-B基线浓度比Z-BOX-A高约四倍，主要Z-BOX-A被排出体外，并在静脉推注给药后大量富集于胆汁。事实上，如果仅仅给予Z-BOX-B，Z-BOX-B浓度显著增高，强烈表明区域异构体之间的竞争。虽然对有竞争性的Z-BOX-A理论背景还有待进一步研究，我们得出这样的结论,即Z-BOX-A的存在抑制其异构体Z-BOX-B的排泄。血清消失的Z-BOX-B没有未变的标记分子排泄到胆汁，强烈表明在消除之前进行了进一步的代谢转化。直接的和选择性的富集于胆汁中的Z-BOX-A，表明这一适当的运输机制，有效地降低了血清浓度。这进一步支持了这个观点，即越高浓度，小管细胞的排泄能力更强，可以在体内局部实现。从患者胆囊切除术获得的人体胆汁标本具有较高浓度的Z-BOX-A，相比于Z-BOX-B，这与在大鼠胆汁中这些化合物的基线浓度相反。除了改变组成的病理性胆汁样品，这种差异可能是由于血红素来源的四吡咯化合物，中间胆红素氧化产物，或肠道菌群对这些BOXes潜在形成的影响。
支持从肝细胞排泄到胆汁，微绒毛提供表面面积增强小管极方便的插入和物质转运。经Z-BOX处理HepG2细胞后，对他们的肌动蛋白细胞骨架的重组，导致球形细胞体的形成和极性的丧失。值得注意的是，观察到的这些反应，在HepG2细胞比患者血浆中所测得的浓度更高。然而，大量的（倍）的Z-BOX-A通过肝细胞排泄途径以及在胆汁淤积条件下很长的曝光时间支持了在刷状缘形态改变的潜在生物学意义。在第二个细胞系中证实了这种效应，即终末分化HepaRG细胞，其中胆管样表型为代表的内生控制。两种表型经Z-BOX-A处理后不同的分裂反应符合特定的接收系统，Z-BOX-A似乎局限于肝细胞样表型。BOXes诱导的肝细胞应激可能损害胆汁分泌功能。有趣的是，这种BOXes导致的胆汁淤积的影响可能类似于前体血红素，尤其是由于遗传缺失或亚铁螯合酶活性的化学抑制导致的原卟啉积累在人类或红细胞生成原卟啉模型的小鼠。
综上所述，我们认为Z-BOX-A和-B是具有生物活性的内源性降解产物，差异性的与肝脏相互作用。因此，我们的数据引入了迄今为止完全归因于胆红素的细胞毒效应的概念，至少部分是由血红素的高降解产物所介导的。（本文图标略）
（本文编辑：赵春燕）
罗磊译赞赏
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